Главный герой игры — Леон Скотт Кеннеди, бывший также главным героем «Resident Evil 2». В начале игры Леон напоминает о недавнем решении Президента США уничтожить город Раккун-Сити (Raccoon-city) ядерной ракетой и рассказывает о последующем падении акций, банкротстве и исчезновении корпорации «Umbrella». С тех событий прошло 6 лет, Леон работает в Секретной Службе США, и получает задание спасти дочь президента — Эшли Грэхем — которая была похищена неизвестными лицами.
Леон прибывает в деревню, где предположительно скрылись похитители. В скором времени его атакуют местные жители, которые, судя по их поведению, несколько не в себе. По мере развития сюжета игрок узнает о паразитическом организме Лас Плагас (Las Plagas), ископаемые образцы которого были в шахтах, где работали жители деревни. Как оказалось, Лас Плагас выделяли споры, которые попадали в тела жителей и развивались там. Лас Плагас, как упоминается в игре, полностью управляют телом носителя и, вероятно, обладают коллективным разумом. Дальше распространение Лас Плагас подталкивалось местным аристократом Рамоном Салазаром, а также неким Озмундом Саддлером, организатором религиозной секты Лос Иллюминадос, пропагандистом идеи нового мира, который способен управлять паразитами в телах зараженных.

Позже в игре появляются персонажи из старых частей — Ада Вонг и Альберт Вескер, которые хотят захватить образец Лас Плагас с целью использования его для усовершенствования Т-вируса и восстановления «Umbrella». Но в конце выясняется, что Ада водит Вескера за нос, и передаёт паразита некоей организации, которая поручила ей следить за Вескером и играть с ним в кошки-мышки, о чём говорит фраза, адресованная Вескеру вне связи: "Наверное ты не знал, но я не играю по твоим правилам...

Возраст: 27 лет
Рост: 181 см
Вес: 73 кг
Группа крови: В
Информация: Наш старый знакомый-Леон Кеннеди. Он много натерпелся. 6 лет назад он был командирован в Раккун Сити в качестве полицейского. В первый же день его службы случился Инцидент, круто изменивший всю его жизнь. Но время лечит. Теперь Леон работает на президента США. Теперь главная задача Леона-спасти дочку того самого президента. По слухам, Эшли видели в глухой испанской деревушке, куда Леон непременно отправляется.

Имя: Джек Краузер
Возраст: ?
Вес: ?
Группа крови: ?
Информация: Бывший товарищ Леона Кеннеди. Когда-то давно они были лучшими напарниками, теперь всё изменилось-они стали врагами. Джек работает на Саддлера, человека, заказавшего похитить Эшли. Джек заражён неизвестным видом вируса, который меняет Джека.

Имя: Биторез Ментез
Возраст: ?
Вес: ?
Группа крови: ?
Информация: Биторез Ментез - эдакая шишка. Он самый главный в деревне, куда прибывает Леон. Он тоже заражен Лас-Плагас и опять-таки работает на Саддлера. У Бетореза невероятная сила, он с легкостью ломает стены. Однажды, вы с ним столкнетесь и познаете всю его мощь.

Имя: Рамон Салазар
Возраст: ?
Вес: ?
Группа крови: ?
Информация: Предок Салазаров, семьи, запечатавшей Лас-Плагас. Рамон был обманут Саддлером, и кошмар Лас-Плагас был выпущен на свободу. Салазар заражен паразитом.

Имя: Осмунд Саддлер
Возраст: ?
Вес: ?
Группа крови: ?
Информация: Главный лидер Лос Илюминадос заставил Краузера похитить Эшли Грэкхэм. Он также заразил Эшли паразитом. чтобы та в свою очередь принесла смерть в США. У Саддлера необычайные способности. Во-первых он контролирует всех своих "подчиненных", а во-вторых Саддлер заражен паразитом, изменившим всю его сущность.